RESUME JURNAL REPRODUKSI IKAN : “SPERMA SEBAGAI VEKTOR TRANSGENESIS PADA IKAN”

by

Transgenic farm animal production and application

P. Chrenek, A. V. Makarevic h, J. Pivko, J. Bulla

             Selama 3 dekade terakhir ini bioteknologi memiliki tingkat kemajuan umumnya melakukan perubahan tertentu untuk genome. Pada awal tahun 1980-an telah dilakukannya sistem transgenik. Transgenik merupakan penggambaran hewan yang membawa gen eksogen (segmen DNA asing – membangun gen) yang terpadu ke dalam genom mereka. Definisipun terlah diperluas yaitu mencakup binatang yang dihasilkan dari manipulasi molekul DNA genomic endogen, termasuk semu teknik injeksi dari DNA. Jangkauan teknologi transegenesis pun sudah diperluas  untuk organism air seperti salmon dan ikan zebra. Transfer gen dapat direalisasikan melalui :

  1. Penciptaan hewan transgenik melalui gonad
  2. Penciptaan hewan transgenik melalui sel-sel germinal
  3. Penciptaan hewan transgenik melalui dibuhi telur atau embrio

Ada beberapa metode utama yang digunakan untuk pembuatan transgenic hewan, antara lain :

  1. DNA injeksi tunggal

Metode ini melibatkan injeksi langsung dari sebuah konstruksi gen yang dipilih (sebuah gen tunggal atau kombinasi gen) dari anggota lain dari spesies yang sama atau dari spesies yang berbeda, ke dalam pronukleusyang sudah dibuahi ovum. Ini adalah salah satu metode pertama yang terbukti efektif pada mamalia.

  1. DNA injeksi ganda

Pada prinsipnya sama seperti injeksi dari DNA asing ke dalam pronukleus yag terletak pada metode memfasilitasi transfer gen asing ke dalam kedua pronuclei telur yang telah dibuahi.

  1. Injeksi sitoplasma
  2. Embrio stem cell-dimediasi transfer gen
  3. Retrovirus (adenovirus)-dimediasi transfer gen
  4. Penciptaan hewan transgenik melalui sel-sel somatik

Dalam transfer gen somatik, genom penerima berubah, namun perubahan itu tidak diteruskan ke depan generasi.

 Dari uraian singkat tentang dasar transgenik,maka dapat dilihat kembali transgenic pada ikan dari review jurnal-jurnal berikut ini :

 =========================================================

Effect of an osmotic differential on the efficiency of gene transfer by electroporation of fish spermatozoa

Jung-Ha Kang, Goro Yoshizaki, Osamu Homma, Carlos A., Fumio Takashima

             Pada ikan, transfer gen dapat dicapai paling baik dengan injeksi ke dalam sitoplasma telur yang dibuahi. Namun karena korion yang keras dari banyak spesies sehingga memakan waktu dan sama sekali tidak praktis. Maka dari itu metode elektroporasi bisa mengatasi beberapa masalah transfer gen ke dalam telur. Elektroporasi memanfaatkan serangakain elektrik untuk menyerap membrane sel sehingga memungkinkan masuknya molekul DNA ke dalam sel. Selain itu sel-sel sperma dapat digunakan sebgai pembawa untuk memperkenalkan DNA asing ke dalam telur, sehingga memungkinkan produksi missal transgenic hewan. Kondisi osmotik sperma selama elektroporasi, antara faktor-faktor lainnya, adalah satu parameter yang memiliki potensi untuk mempengaruhi efisiensi transfer gen. Spermatozoa ikan dengan fertilisasi eksternal umumnya immotile di testis dan dalam plasma, tapi menunjukkan ledakan ejakulasi motilitas segera setelah masuk kedalam air pada pemijahan. Inisiasi motilitas dipicu oleh perubahan faktor-faktor fisik atau kimia seperti penurunan atau peningkatan osmolalitas. Hyposmotic,pengobatan dapat digunakan untuk meningkatkan penyerapan media ekstraseluler ke dalam sel jika spermatozoa dapat diadakan diam. Dengan demikian, kami berusaha untuk mengeringkan sperma disolusi hiperosmotik dan kemudian rehydrate dalam larutan hyposmotic sampai kondisi isoosmotik ke cairan mani asli tercapai. Kami mengantisipasi penggunaan ini, proses selama elektroporasi akan mempertahankan kesuburan sperma dan memfasilitasi penyerapan DNA asing. Penelitian ini menguji kemungkinan ini dengan menggunakan sperma ikan mas Cyprinus carpio, yang motilitas dipicu oleh kondisi hyposmotic.

            Adapun bahan dan metode yang dilakukan yaitu :

  1. Sumber bahan dan koleksi gamet

Disiapkan 6 jantan dan 3 betina ikan mas berumur antar 5-10 tahun. Untuk betina dilakukan penyitripingan begitu juga dengan jantan, dilakukan dibawah anestesi dan disimpan di atas es pengawetan sampai hari H. Kualitas air mani diperiksa segera setelah pengumpulan dan sesaat sebelum percobaan oleh pengamatan motilitas di air tawar. Jika ada spermatozoa yang immotile segera dibuang.

  1. Pengencer sperma dan penentuan motilita spermatozoa

Tiga Pengencer dengan tekanan osmotik yang berbeda? Isoosmotik, hiperosmotik, dan hypos-MOTIC dengan cairan mani dari ikan mas

  1. Spermatozoa dehidrasi dan rehidrasi

Sperma Dehidrasi diperoleh dengan inkubasi pada rasio 1:4 selama 1 jam pada suhu 0o C. Untuk rehidrasi, sperma dehidrasi (sperma-2 x CCSS campuran)  adalah dicampur dengan volume yang sama dari 0,5 x CCSS, menghasilkan medium sekitar isos- MOTIC dengan cairan mani yang asli (sekitar 330 mOsm/kg).

  1. Plasmid PRSV-CAT DNA persiapan dan kondisi elektroporasi
  2. Viabilitas dan 32P-PRSV-CAT DNA konten sperma electroporated
  3. PRSV-CAT DNA dimasukkan kedalam telur
  4. Analistik statitik

Maka didapatkan hasil

  1. Spermatozoan dehidrasi dan rehidrasi
  2. Viabilitas dan 32P-PRSV-CAT DNA konten sperma electroporated
  3. PRSV-CAT DNA dimasukkan kedalam telur

Kemudian didapatkan kesimpulan bahwa efisiensi memperkenalkan DNA asing ke Telur ikan mas melalui elektroporasi sperma dapat ditingkatkan jika sperma awalnya dehidrasi dan kemudian direhidrasi selama elektroporasi. Bukti pentingnya sebuah osmotic diferensial untuk penggabungan DNA dalam sperma lebih menarik dalam studi gen mentransfer ke telur dan kurang jelas dalam studi penyerapan DNA menjadi spermatozoa. Observasi ini memberikan dukungan kepada pendapat bahwa fluks osmotically diinduksi selama elektroporasi dapat memainkan peran utama dalam menentukan pengambilan DNA asing ke dalam sperma. Sayangnya, kami tidak mengejar inseminasi telur dengan sperma nonelectroporated direhidrasi dengan adanya DNA dan oleh karena itu kita tidak dapat memastikan jika diferensial osmotik per se dapat digunakan untuk menghasilkan transgenik ikan. Ikan diproduksi dengan sperma electroporated dibandingkan dengan yang diperoleh dengan tidak diobati sperma, tapi masih baik dalam tingkat yang dapat diterima untuk produksi benih. Juga, mungkin mungkin untuk meningkatkan angka ini dengan minimalisasi kerusakan yang ditimbulkan pada sperma sel selama elektroporasi. Misalnya, gangguan motilitas diamati di electroporated sperma dalam kaitannya dengan sperma segar, dan lebih jelas dalam sperma electroporated dalam kondisi isoosmotik daripada sperma electroporated di hipertonik dan rehidrasi kondisi. gen asing dapat secara efisien ditransfer ke telur ikan oleh elektroporasi selama rehidrasi sperma dehidrasi. Pendekatan dirancang dalam penelitian ini memiliki potensi untuk transfer gen massal di finfish dan kerang.

 =========================================================

Electroporated Sperm Mediation of a Gene Transfer System for Finfish and Shellfish

HUAI-JEN TSAI

             Sebuah sistem transfer gen memberikan pendekatan yang kuat untuk mempelajari regulasi gen in vivo dan untuk memperoleh transgenik varietas hewan yang memiliki genetik khusus sifat. Banyak teknik telah dikembangkan untuk memperkenalkan DNA molekul ke dalam embrio. Dalam hewan air, injeksi adalah metode yang paling popular. Dibandingkan dengan pekerjaan membosankan injeksi, elektroporasi dianggap menjadi alternatif lebih mudah. karena elektroporasi telur dibuahi dapat menghasilkan 10 sampai 100 kali lebih besar dari angka bisa injeksi. Namun, gen efisiensi transfer masih tidak cukup tinggi untuk menangani jumlah sangat besar telur melahirkan dalam sangat singkat waktu oleh spesies akuakultur. Ada beberapa keuntungan dalam menerapkan spermmediated Teknik transfer gen pada ikan. Pertama, hal ini Teknik dianggap massa”” transfer gen. Kedua, teknik ini mengatasi beberapa kelemahan dari konvensional transfer gen sistem yang dihasilkan dari karakteristik telur, seperti kekaburan, daya apung kekakuan,, terlihat pronuclei, dan chorion tangguh. Ketiga, DNA asing harus ditransfer ke inti. Jika Telur yang dibuahi electroporated dengan DNA asing, DNA fragments memiliki kesempatan lebih besar untuk ditransfer ke beberapa tempat lain selain blastodisc karena yang Volume sangat kecil dalam telur yang telah dibuahi. Keempat, sperma ikan mudah untuk menangani karena hanya menambahkan air sudah cukup untuk mengaktifkannya. Kelima, sperma air hewan dapat disimpan oleh kriopreservasi sehingga diperlakukan sperma selalu siap untuk penggunaan.

            Adapun bahan dan metode yang dilakukan yaitu

  1. Preparasi DNA, gamet dan elektroporasi

Disiapkan abalone yang sudah matang gonad. Suspense sperma yang terkandung (1-2)x108 sel/ml. Plasmid disusun oleh CsClethidium bromida ultrasentrifugasi. Elektroporasi dilakukan dalam larutan elektroporasi 100-µl mengandung 107 sperma dengan DNA molecules. Setelah sperma yang electroporasi, diikuti dengan fertilisasi invitro.

  1. Ekstrasi genomic DNA, Analisa Southern blot dan PCR

Genomic DNA diisolasi dari sperma dan terisolasi dari larva dan ikan dewasa yang dianalisa dengan cara Southern blot dan PCR.

  1. Membalikkan Transcriptase-PCR(RT-PCR) dan Northern blotting

RT-PCR dilakukan dalam larutan 50 µl- terdiri dari 20-30 template ng, 50 pmol masing-masing primer, 250 mM dNTP masing-masing, dan 0,5 U Taq DNA polimerase. PCR terdiri dari 35 siklus denaturasi pada 95 ° C selama 50 detik, didinginkan pada 50 ° C selama 1 menit, dan ekstensi pada 72 ° C selama 1 menit.

  1. Pengujian Transient Chloramphenical acetyltransferase (CAT)

Sekumpulan dari 400 trochophore – tahap larva dikumplkan, dicuci, dan dianalisis.

            Kemudian hasil dan pembahasannya yaitu sel sperma yang diinkubasi dengan molekul DNA asing tanpa elektroporasi hasilnya negative. DNA genom sperma abalone dikumpulkan (106 sel)  diekstraksi dan dianalisis oleh PCR dan Southern  blotting. Hasil juga menunjukkan bahwa 138-bp PCR produk dan band yang positif, yang berasal dari transgen, hadir dalam sperma electroporated dengan DNAmolecules asing. Ditemukan bahwa sperma abalone ketika dilakukan dengan tidak bertahap kehilangan mobilitas  mereka ketika amplitude meningkat dari 2 sampai 10 kV. Adanya pengaruh kekuatan medan ketika kekuatannya meningkat dan konsentrasi DNA pada tingkat penetasan, kelainan dan gen.

 =========================================================

Transgene transmission in South American catfi sh (Rhamdia quelen) larvae by sperm-mediated gene transfer

TIAGO COLLARES, VINICIUS FARIAS CAMPOS, FABIANA KOMMLING SEIXAS, PAULO V CAVALCANTI, ODIR A DELLAGOSTIN, HEDEN LUIZ M MOREIRA and JOAO CARLOS DESCHAMPS

 1.

  • Latar Belakang

            Saat ini perlu adanya pengembangan metode transfer gen secara sederhana untuk digunakan dalam kegiatan akuakultur. Selama beberapa tahun terakhir, spermatozoa telah diteliti untuk melayani sebagai vektor untuk gen transfer teknologi hewan transgenik dan beberapa yang berbeda pendekatan telah dikembangkan. menggambarkan transmisi ditingkatkan hijau fluorescent protein (EGFP) transgen di lele perak oleh sel sperma mengalami SMGT dengan membandingkan osmotik diferensial dan / atau elektroporasi dan inkubasi dengan adanya atau tidak adanya plasma mani sebagai sarana meningkatkan tingkat embrio transgenik.

2. Bahan dan metode

2.1 Persiapan vektor pEGFP-N1

pEGFP-N1 plasmid dibeli dari CLONTECH (Mountain View, CA, USA). Panjang keseluruhannya adalah 4,7 kb. EGFP diungkapkan di bawah kendali CMV promotor. EGFP memiliki puncak eksitasi tunggal pada 488 nm dan puncak maksimal emisi pada 507 nm.

2.2 Pengumpulan dan manipulasi gamet

Percobaan dilakukan dengan menggunakan enam lele jantan dewasa  dengan berat badan rata-rata 534 g dan rata-rata Panjang total dari 38 cm. Hewan yang dipelihara di UFPel Budidaya Station, di 500 fi l tangki bre dengan air tertutup sirkulasi. Human chorionic gonadotropin (hCG) pada 400 UI / kg digunakan untuk menginduksi spermiation artifi finansial. Setelah 8 jam induksi, air mani dikumpulkan dengan immobilisasi dan membutakan hewan dengan handuk ed humidifi untuk menghindari stres dan cedera. Pori urogenital dikeringkan dengan handuk kertas untuk mengurangi kemungkinan kontaminasi dengan air, kotoran atau urine, dan aktivasi sperma konsekuen dengan NaCl (50 mOsm / kg). Semen disedot dengan  jarum suntik (5.0 ml), disimpan dengan benar diidentifi kasi 15 ml Falcon tabung, dan dipertahankan pada 8 º C selama transportasi ke Federal University of Pelotas Biotechnology Center, di mana perawatan dilakukan.

2.3 Pengencer Sperma

Tiga Pengencer dengan osmolalities yang berbeda (isoosmotik,) hiperosmotik dan hyposmotic digunakan.

1 – dehidrasi dan rehidrasi (DR), pengobatan

2 – dehidrasi, rehidrasi dan elektroporasi (DRE), pengobatan

3 – elektroporasi saja (E), pengobatan

4- Inkubasi dengan plasma seminal (INC), dan pengobatan

5- Inkubasi tanpa adanya plasma seminal (INCSP).

Kontrol terdiri dari sampel semen segar diencerkan dalam isoosmotik media tanpa DNA eksogen. Kering sekali sperma diperoleh dengan inkubasi di hiperosmotik (595 mOsm / kg) lele Pengencer selama 1 jam pada 5 º C. Untuk rehidrasi, sperma dehidrasi dicampur dengan volume yang sama hyposmotic (125 mOsm / kg) lele Pengencer yang mengandung DNA asing, menghasilkan media yang isoosmotik untuk uid fl asli mani pada sekitar 320 mOsm / kg. DR sampel sperma diserahkan ke elektroporasi. Ini adalah dilakukan dengan 3,0 V kapasitansi, 200 ohm dan 2,5 kV untuk semua electroporated sampel menggunakan Electroporator MicroPulser. INC pengobatan dilakukan dengan inkubasi dalam sperma: kompleks isoosmotik media DNA pada rasio 1:1 selama 1 jam pada 5 º C. Untuk pengobatan INCSP, sampel yang dicuci dengan sentrifugasi (500 × g selama 10 menit pada 5 º C) untuk menghapus plasma mani.

2.4 Morfologi Sperma

Morfologi sperma diamati dari mikroskop yang diusulkan adalah divisualisasikan dengan memindai electron mikroskop untuk mengevaluasi integritas sperma dan menentukan dimensi seluler dari spermatozoa spesies ini. Semen dimasukkan ke gelas penutup dan dicampur dengan 2,5% glutaraldehid dalam air. Setelah tercampur, ditambah 1% osium tetroksida, dehidrasi dengan etanol dinilai dan dikeringkan dengan metode titik kritis, mereka diamati di bawah mikroskop elektron.

2.5 Fertilisasi in vitro

Pada motilitas, sperma station (SM) dan TAD analisis setelah perawatan dan transportasi yang diukur. Perempuan yang sebelumnya diinduksi diekstrusi untuk koleksi telur. Ini ditimbang dan dibagi ke piring kaca untuk fertilisasi dengan sperma dari setiap perlakuan. Sekitar 9000 telur yang digunakan dalam setiap perlakuan (3000 telur per pengulangan), sebesar 54 000 telur. Tiga ribu telur yang dicampur dengan 1 ml air mani diobati, diaduk dengan tongkat kaca dan kemudian diaktifkan dengan 150 ml aktivasi Solusi (NaCl 50 mOsm / kg). Setelah pembuahan, telur yang diselenggarakan dalam inkubator terendam, di kolam renang dengan air benar dikontrol untuk pengembangan embrio pada standar suhu (23 º C), pH (7,6), CO2 (0,5%), alkalinitas (21%) dan saturasi oksigen (75%).

2.6 Evaluasi ekspresi EGFP Larva menetas dipertahankan dalam benar dikontrol di kolam renang selama 96 jam pasca menetas pasca. Setelah 100 jam terjadi pembangunan embrio, berukuran sekitar 0,8 cm, dievaluasi untuk protein gen hijau uorescent (GFP) Ekspresi bawah mikroskop uorescence. Sembilan puluh hewan per perlakuan dievaluasi. Semua hewan yang disajikan setiap variabel tingkat ekspresi selama analisis fl uorescence dianggap positif untuk EGFP.

2.7 PCR dan analisis sekuensing Dua puluh dari 90-hari hewan dari setiap perlakuan yang secara acak dipilih untuk ekstraksi DNA genomik dari otot jaringan. DNA diperoleh oleh PureLink ™ DNA Genomic Purifi kation Kit. Polymerase chain reaction (PCR) dilakukan dengan pEGFP-N1-spesifik c oligonukleotida (5′-CGGGACTTTCCAAAATGTCG -3 ‘ dan 5’-GAAGATGGTGCGCTCCTGGA -3 ‘) untuk memperkuat 500 pasangan basa (bp) fragmen. Reaksi PCR dilakukan dalam Mastercycler gradien termal cycler diprogram untuk langkah denaturasi awal (2 menit pada 94 ° C) diikuti oleh 30 siklus dari 1 menit pada 94 ° C, 1 menit pada 50 ° C, dan 1 menit pada 72 ° C. Siklus terakhir diikuti dengan inkubasi dari 7 menit pada 72 ° C. Sampel kemudian disimpan pada suhu -20 ° C.

2.8 statistik analisis ANOVA digunakan untuk mengevaluasi efek dari perawatan di SM, TAD, pemupukan tingkat (FR), dan tingkat penetasan (HR), diikuti dengan uji Duncan untuk perbandingan berarti (SAS Institute Inc, Cary, NC).

3. Hasil

3.1 Parameter Reproduksi invitro

Analisis statistik menunjukkan bahwa perlakuan memiliki signifikan bisa berpengaruh (P <0,05) terhadap motilitas, TAD, FR dan HR.

3.2 Motilitas Sperma

DRE pengobatan mengakibatkan parameter motilitas tinggi dibandingkan dengan perlakuan kontrol (P <0,05). Ini adalah mungkin karena mantan refl dari diferensial osmotik ditambah dengan elektroporasi yang mempromosikan reorganisasi yang plasma membran dengan aktivasi natrium dan kalium pompa, motilitas sperma dan merangsang aktivitas sel. Motilitas pada kelompok perlakuan DR tidak berbeda dari yang di kelompok kontrol, tetapi berbeda ketika dibandingkan dengan kelompok lain. Kelompok elektroporasi menunjukkan signifikan hilangnya bisa motilitas dibandingkan dengan kontrol, DR DRE dan kelompok, namun, tidak ada Perbedaan bila dibandingkan dengan perlakuan inkubasi Kelompok dengan adanya atau tidak adanya plasma mani dan DNA asing. Kami mengamati bahwa penghapusan protein plasma mani, serta konstituen mani lainnya, dipromosikan kerugian signifikan tidak bisa motilitas pada kelompok INCSP (P <0,05). Berdasarkan koefisien korelasi Pearson coeffi, itu adalah mungkin untuk mengamati korelasi signifikan antara tidak bisa motilitas x TDA dan motilitas x FR, tetapi tidak antara motilitas dan SDM. Hal ini menunjukkan bahwa faktor-faktor lain selain kehadiran DNA asing dari HR.

3.3 Waktu durasi aktivitas (TAD)

Durasi untuk spermatozoa motil tetap, adalah penting karena lamanya waktu bahwa spermatozoa berinteraksi dengan gamet betina selama proses pembuahan. Statistik analisis untuk parameter ini memisahkan perawatan berbeda signifikan kelompok. Pada TAD untuk kelompok kontrol (217,0 ± 9,0 s) lebih tinggi dari itu untuk kelompok yang menjalani pengobatan lain (P <0,05). Tidak ada perbedaan TAD antara DR dan Dre kelompok perlakuan. Perlakuan E berikut TAD adalah signifi kan lebih tinggi bila dibandingkan dengan INC dan Perawatan INCSP, namun, itu signifi kan lebih rendah dibandingkan dengan perlakuan DR, Dre dan kontrol. Tingkat rendah TAD (44,6 ± 5,5 s) diamati pada kelompok perlakuan INCSP. Penghapusan konstituen dari hasil plasma mani dalamvhilangnya sumber energi untuk mempertahankan motilitas sperma.vItu mungkin untuk mengamati korelasi signifikan antara tidak bisa TAD × motilitas, TAD × FR dan TAD × HR.

3.4 Dalam tingkat fertilisasi in vitro (FR)

Analisis statistik untuk parameter FR memisahkan perawatan menjadi tiga kelompok signifi kan berbeda. Berikut FR DRE pengobatan (90,3 ± 0,58%) melakukan tidak berbeda dari kontrol (89,0 ± 5,29%), tetapi berbeda dari yang dari perawatan lain. DR pengobatan menghasilkan FR lebih rendah (78,0 ± 2,65%) dibandingkan DRE dan control perawatan tetapi signifi kan lebih tinggi bila dibandingkan dengan perawatan lain, yang tidak berbeda antara sendiri (E = 64,6 ± 5,03%, INC = 65,3 ± 4,16% dan INC SP = 69,6 ± 0,58%). Efek ini mungkin karena kelelahan seluler akibat dari peningkatan motilitas karena osmotic diferensial ditambah elektroporasi, yang dapat diamati dalam TAD dari DRE dan kelompok kontrol ..

3.5 Ratio Penetasan  (HR)

HR embrio adalah persentase embrio yang muncul dari telur dibuahi. Untuk parameter ini, dua kelompok dengan a signifikan bisa statistik perbedaan yang diamati. Itu kontrol, dan DR DRE kelompok perlakuan tidak berbeda diantara mereka, namun mereka berbeda dari E, INC dan INCSP kelompok perlakuan, yang lagi-lagi tidak berbeda antara sendiri. Tingkat penetasan meningkat ketika diferensial osmotik diterapkan pada sel sperma, yang menunjukkan bahwa elektroporasi tidak perlu untuk meningkatkan tingkat ini. Inkubasi sel sperma / DNA, dengan adanya atau tidak adanya plasma mani dalam kondisi isoosmotik, menunjukkan efek yang sama untuk parameter ini.

3.6 Morfologi Spermatozoa

Morfologi data, sebelumnya tidak dipublikasikan, yang ciri morfologi spermatozoa, diukur: kepala dengan diameter 1 m dan panjang 2 m, ekor dengan diameter 120 nm dan panjang dari 20 pM. Kehadiran akrosom yang tidak diamati dalam sel-sel ini. Morfologi sperma menunjukkan aglutinasi sel dengan perawatan E dan INCSP, yang tidak diamati dengan perawatan lain, tapi ada tanpa kehilangan integritas dengan semua perawatan. Sperma patologi diamati pada 20% dari semua sampel dianalisis, yang dapat diterima. Ini adalah hasilnya prosedur yang dilakukan untuk manipulasi sperma dan cedera disebabkan oleh perawatan. Namun, hal ini tidak mempengaruhi fertilisasi proses pengobatan masing-masing.

3.7 ekspresi EGFP Transient dan analisis PCR

Semua perawatan yang mampu menghasilkan hewan dengan derajat yang berbeda ekspresi GFP transien otot dan / atau saraf jaringan, kecuali untuk kelompok control (fi gurasi 2). Sebanyak 44% (40/90) dan 63% (57/90) dari transgenik fi sh dari DR dan kelompok perlakuan DRE diamati, masing-masing. Kelompok-kelompok ini tidak berbeda signifi kan (P> 0,05), menunjukkan bahwa E tidak meningkatkan tingkat ekspresi. Selain itu, hasil pengobatan DR tidak berbeda dengan perlakuan E (34%, 31/90), menunjukkan bahwa diferensial hanya osmotik dapat mempromosikan pengambilan DNA asing dan menentukan ekspresi yang sama tingkat, akibatnya, tidak perlu menggunakan elektroporasi peralatan. Pengobatan INCSP mengakibatkan tingkat ekspresi (38%, 34/90) yang tidak berbeda dari pengobatan dengan E, menunjukkan bahwa penghilangan unsur biologis plasma mani dapat menyebabkan peningkatan penggabungan DNA asing tanpa membutuhkan peralatan canggih. INC pengobatan menghasilkan tingkat ekspresi yang lebih rendah, dengan 8% (7/90) dari hewan mengekspresikan GFP. Hal ini dapat dijelaskan oleh adanya protein menghambat dan DNases dalam mani plasma (data tidak ditunjukkan). PCR analisis mengkonfirmasi kehadiran transgen dalam DNA diekstraksi dari kelompok perlakuan yang berbeda, kecuali kelompok Kontrol. Sampel kontrol DNA Semuanya negatif. PCR produk, sesuai dengan 500 bp dari pEGFP-N1 urutan vektor, terdeteksi pada 8 dari 20 (40%), 12 dari 20 (60%), 5 dari 20 (25%), 1 dari 20 (5%) dan 5 dari 20 (25%) fi sh dari DR, DRE, E, INC dan INCSP pengobatan kelompok, masing-masing. DNA asing tidak terdeteksi dalam dari 20 ikan kontrol yang diperiksa. Perbedaan dalam PCR positif antara tingkat DR dan DRE, serta antara E dan INCSP, dan DR dan E kelompok tidak signifikan bisa (P> 0,05), tetapi antara Dre dan kelompok E itu sangat signifikan tidak bisa (P <0,05).

 4. Diskusi

Dalam studi ini, kami telah menunjukkan bahwa spermatozoa dapat berhasil dimanipulasi untuk menghasilkan ikan transgenik , setelah menerapkan diferensial osmotik diikuti oleh elektroporasi atau tidak, atau melalui inkubasi pendek dengan DNA asing di hadapan atau tidak adanya plasma mani. Namun, perbedaan statistik yang penting diamati dengan semua perawatan. Kami menunjukkan bahwa pengobatan yang digunakan dalam penelitian ini dapat mempengaruhi parameter reproduksi. SM meningkat pada kelompok DRE bila dibandingkan dengan kontrol dan kelompok perlakuan lainnya. Sebaliknya,sedikit penurunan dalam SM setelah elektroporasi spermatozoa. Memang, TAD, FR dan HR muncul untuk mengikuti pola yang sama seperti yang ditunjukkan oleh tingginya pada FR dan HR setelah pengobatan dengan DRE. Hasil ini menunjukkan bahwa spermatozoa lele perak bisa mentolerir elektroporasi dari DR, namun penelitian lebih lanjut harus dilakukan untuk menjelaskan mekanisme ini. Sebaliknya, morfologi sperma tampaknya tidak akan terpengaruh oleh pengobatan. Kita telah menunjukkan bahwa elektroporasi tidak perlu, karena tidak ada perbedaan signifikan antara tidak ada DR dan kelompok perlakuan DRE (P> 0,05), meskipun terjadi perbedaan secara numerik tapi menguntungkan untuk DRE diamati. Fluoresensi mikroskop, PCR dan sequencing hasil analisis menunjukkan bahwa transgen memasuki sel keturunan mengikuti semua perawatan. Ada atau tidak adanya protein plasma seminal sangat mengganggu SMGT. Dalam penelitian ini, adalah mungkin untuk mengamati ini melalui hasil parameter reproduksi. Itu telah menunjukkan bahwa keberadaan plasma seminal protein penting untuk pemeliharaan kualitas sperma ikan. Penggunaan ikan di penelitian daerah tertentu  dapat mengurangi secara signifikan eksploitasi mamalia, menurunkan biaya dan mempercepat proses penelitian. Selain itu, fi sh dapat berguna untuk memantau kesehatan potensial bahaya yang terkait dengan paparan bahan kimia di perairan tersebut lingkungan. Singkatnya, penelitian kami menunjukkan transgen transmisi DNA eksogen pada  larva lele melalui teknologi SMGT.

DAFTAR PUSTAKA

Chrenek, P., A. V Makarevich, J. Pivko dan J. Bulla. 2010. Transgenic Farm Animal Production and Application. Journal Animal Science 43, 2010 (2) : 45-49.

 Collares, T., Vinicius, Fabiana, Paulo, Odir, Heden dan Joao. 2010. Transgene Transmission in south American catfish (Rhamdia quelen) larvae by Sperm-Mediated Gene Transfer. Journal Biosci 35(1) : 39-47.

Kang, Jung-Ha, Goro Yoshizaki, Osamu Homma, Carlos A. dan  Fumio Takashima. 1999. Effect of an osmotic differential on the efficiency of gene transfer by electroporation of fish spermatozoa. Aquaculture 173 (1999) : 297–307.

Tsai, Huai. 2000. Electroporated Sperm Mediation of a Gene Transfer System for Finfish and Shellfish. Molecular Reproduction and Development 56:281-284.

Tinggalkan komentar